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示例說明書,人白介素6(Interleukin 6 ,IL-6) ELISA 試劑盒

Cat No.EIA05884h  

人白介素6(Interleukin 6 ,IL-6) ELISA 試劑盒  

尊敬的客戶,感謝你選用本公司的產品。本產品適用于體外定量檢測人血清、血漿或細胞培養上清液、組織等中天然和重組的IL-6 濃度。檢測其他特殊樣本請咨詢本公司技術支持。試劑盒僅供科研使用。 使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑盒組分。 如有疑問,請聯系武漢新啟迪生物科技有限公司。 您將得到我們的全方位服務。

本試劑盒采用雙抗體夾心法,雙抗體夾心原理,是基于要測試的抗原具有二價以上的特性,能識別包被抗體,同時能識別檢測抗體,具體過程如下:

(1)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體,洗滌除去未結合的抗體及雜質,并用無關蛋白封閉空余結合位點。

(2)加受檢標本使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

(3)加生物素標記抗體,使固相免疫復合物上的抗原與生物素標記抗體結合。徹底洗滌未結合的生物素標記抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

(4)加辣根過氧化物酶標記親和素,使生物素標記抗體與辣根過氧化物酶標記的親和素結合。徹底洗滌未結合的酶標記物。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

(5)加入底物顯色,即可計算標本濃度。

(6)注:一個抗體分子上可以標記上若干個生物素分子,一個生物素分子可以結合一個辣根過氧化物酶標記的親和素,從而帶來了大量的辣根過氧化物酶結合到抗體上,比傳統的直接辣根過氧化物酶標記抗體具有更高的敏感性和放大效應。

【人IL-6酶聯免疫試劑盒檢測原理】

本實驗采用雙抗體夾心ELISA法。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定試劑盒(ELISA)。預先包被的抗體為抗人IL-6單克隆抗體。檢測相抗體為多克隆抗體,經生物素(biotin)標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后,PBSTBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應;經過PBSTBS的徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。




















【試劑盒組成】

名稱 96 Tests 48 Tests 保存條件 1.人IL-6抗體包被板條 8×12 8×6 4/-20℃

2.人IL-6標準品 2 支(凍干) 1 支(凍干) 4/-20℃ 3.濃縮生物素化人IL-6抗體 1支 1 支 4/-20℃

4.濃縮酶結合物(ABC) 1支 1 支(避光) 4/-20℃

5. 酶結合物(ABC)稀釋液 1支 1支 4/-20℃

6.抗體稀釋液 1瓶 1 瓶 4/-20℃

7.標準品稀釋液 1瓶 1 瓶 4/-20℃

8.樣品稀釋液 1瓶 1 瓶 4/-20℃

9.濃縮洗滌液 1 瓶(25×) 1 瓶(25×) 4/-20℃

10.顯色劑A 1 瓶 1 瓶 (避光) 4/-20℃

11.顯色劑B 1 瓶 1 瓶 4/-20℃

12.終止液 1 瓶 1 瓶 4/-20℃

13.說明書 1 份 1 份 室溫


【試驗所需自備試驗設備和器材】

1. 酶標儀(450nm檢測波長濾光片,570nm630nm校正波長濾光片) 。

2. 洗板機(可調注液量,保證每孔350μl洗液而不溢出)。

3. 超凈工作臺,生物安全柜,通風柜。

4. 高精度單道加液器(量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).

5. 高精度多道加液器(8道或12道,量程為50-300μl).

6. 37恒溫箱。

7. 低溫離心機。

8. 電冰箱(4℃,-20℃,-86℃.

9. 分析天平。

10. 剪刀,鑷子,鉗子等。

11. 漩渦混合儀,低頻振蕩器等。

【試驗所需自備試驗耗材及試劑】

1. 離心管(容量為1.5ml,5ml等)。

2. 一次性吸頭(量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl.

3. 純凈水或蒸餾水。

4. 坐標紙。

5. 吸水紙。

6. EDTA,枸櫞酸鈉,肝素

【標本收集注意事項】

1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原,無內毒素試管。

2. 血清和血漿避免使用溶血,高血脂標本。

3. 標本應清澈透明,懸浮物應離心去除。

4. 標本收集后若不及時檢測,需按一次使用量分裝,凍存于-20,-80電冰箱內,避免反復凍融。  

5. 可根據標本的實際情況,做適當倍數稀釋(建議做預實驗,以確定稀釋倍數) 。

6. 收集標本,盡量做到雙份的用量,避免一次實驗失敗,重復實驗時標本缺失,從而耽誤實驗進程。

7. 收集標本時,應該做好防護措施(比如戴手套,口罩,護目鏡等),認為所有標本都具有一定的潛在危險性。

8. 樣本處理應該在生物安全柜里面,并且正確使用生物安全柜。

【標本處理辦法】

1. 血清:將采集的全血靜置冰箱4過夜,然后1000-3000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-201-3個月)或-803-6個月)保存。

2. 血漿:用EDTA,枸櫞酸鈉,肝素等作為抗凝劑,加入血液混勻后,1000-3000rpm

 10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-201-3個月)或-803-6個月)

 保存。

3. 組織勻漿:切取組織塊,0.01MPBS中過洗一次;按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例,在冰水中勻漿。勻漿完成后,5000-10000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-201-3個月)或-803-6個月)保存。

4. 細胞培養上清:1000-3000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-20℃1-3個月)或-80℃3-6個月)保存。

5. 尿液,腹水,腦脊液等:1000-3000rpm離心10分鐘,取上清立即測試,暫時不測可以放入-20℃1-3個月)或-80℃3-6個月)保存。

注:樣品稀釋的一般原則

用戶須查閱相關文獻了解標本內待測因子的含量,決定適當的稀釋倍數,以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的最佳檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。

【注意事項】

1.試劑盒使用前請保存在2-8℃。除復溶后的標準品,其他成分不可凍結。

2.濃縮生物素化人IL-6抗體,濃縮酶結合物體積小,運輸中顛簸和可能的倒置,會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘,以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。

3.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,使結晶完全溶解后再配制洗滌液。

4.測試過程中,人IL-6凍干標準品為一次性使用,不得分裝。因其濃度較低,溶解兩小時候后,會迅速失活。

5.操作嚴格按照說明書進行,本試劑不同批號組分不得混用。

6.配制試劑時,要用旋渦混合儀混勻。加入孔內的試劑,充分混勻對測試結果尤為重要,最好使用微量振蕩器(使用最低頻率),如無微量振蕩器,可在反應前手工輕輕晃動酶標板1分鐘,例如做圓周動作,使加入孔中的反應液混勻。

7.實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規范操作,并在使用前充分預熱。

8.酶免試驗中人IL-6標準品和樣本檢測時建議作復孔。

9.將不用的微孔板放進原鋁箔袋中,置2-8℃保存。

10.顯色液對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。

11.超過使用有效日期的試劑盒不能應用于實驗中。

12.試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準,使用雙波長檢測時,波長應該設置為450nm630nm.

13.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸,使用時必須注意安全。

14.各步驟加樣均應使用加樣器,并經常校準其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。

15.每次試驗測定的同時做標準曲線,最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔最高濃度的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(×n)。

16.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

17.以洗板機洗板時,每孔注液量不應少于350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時, 用帶紙屑的吸水材料應慎重, 防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發生反應。

18.用終止液終止反應后,請于10分鐘內讀取OD值。

19.進行復孔實驗時,結果計算一定要求平均值。

20.標本溶血可能會有假陽性結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

21.試驗時,應該將加過樣品的板條放于密閉盒內,并保持濕度約60%左右。

22.為保證恒溫箱內的溫度為37℃,恒溫箱的溫度要經常校準。以確保實驗溫度保持恒定。

23.48T的試劑盒,所有組分均為96T50%的量。

24.如與英文說明書有異,以英文說明書為準。

【檢測前準備工作】

1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫后方可進行試驗。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回 。

3. IL-6標準品: 加入標準品稀釋液1.0ml至凍干人IL-6標準品中,靜置10分鐘,待其充分溶解后,輕輕混勻(濃度為300 pg/ml),之后在管身標注,然后根據需要進行稀釋。(建議標準曲線使用以下濃度:300、150、75、37.5、18.8、9.4、4.7 pg/ml)。 注意:務必要保證凍干標準品徹底溶解和混勻。

4. 標準品稀釋方法圖例: 取7支潔凈的試劑管,分別標注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧.  每管加入300μl標準品稀釋液。從第管內取出300μl加入到第管,混勻后,再從第管取出300μl加入到第管,以此類推至第管。第管為標準品稀釋液,作為陰性對照使用。


















注:復溶標準品原液(300 pg/ml)請廢棄,不可重復使用。

5.生物素化人IL-6抗體工作液:按當次試驗所需用量,用抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100),配置成生物素化抗體工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。

6.酶結合物工作液:按當次試驗所需要用量,用酶結合物稀釋液稀釋濃縮酶結合物(1:100),配置成酶結合物工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。

7.TMB顯色工作液:在使用之前30分鐘,按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份(91)的比例配制TMB顯色工作液。

【洗滌方法】

1.自動洗板機:要求注入的洗滌液為350μl,注入與吸出間隔2030秒。確保機器運用熟練后,再投入實驗中使用。

2.手工洗板:每孔加洗滌液350μl,靜置30秒后甩盡孔內液體,在吸水紙上拍干。手工洗板時,注意加入洗液的過程中,不要造成孔間污染,從而出現跳孔的現象。

【操作步驟】

1. 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條,未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內封存于2-8℃。

2. 預留空白孔(若使用雙波長讀板,空白孔可以不設)。

3. 分別將標本或不同濃度人IL-6標準品(0pg/ml孔加標準品稀釋液)加入相應孔中(100μl/),37℃孵箱孵育90分鐘。

4. 提前30分鐘制備生物素化人IL-6抗體工作液。

5. 洗板2次。

6. 加入生物素化人IL-6抗體工作液(100μl/)。37℃孵箱孵育60分鐘。

7. 提前30分鐘制備酶結合物工作液。室溫避光放置。  

8. 洗板3次。

9. 除空白孔外,加入酶結合物工作液(100μl/)。,37℃孵箱,避光孵育30分鐘。

10. 洗板5次。

11. 加入TMB顯色工作液(包括空白孔)100μl/孔,37℃孵箱,避光孵育,當標準曲線高濃度的顏色較深,有明顯的顏色梯度的時候,即可終止。試驗顯色反應請勿超過30分鐘。

12. 加入終止液(包括空白孔)100μl/孔,混勻后即刻測量OD450nm)值(10分鐘內)。  

 

【結果判斷】

1.每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值。(若不減零孔值,標準曲線的零孔應相交于Y軸)

2.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標,OD值作縱坐標,以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析,如curve expert 1.3進行結果計算。

3.若標本OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測,計算濃度時應乘以稀釋倍數。

【參考曲線】












注意:本圖僅供參考,應以同次試驗標準品所繪標準曲線來計算標本含量。

【操作程序總結】

準備試劑,樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品,37℃反應90分鐘

洗板2次,加入生物素化抗體工作液,37℃反應60分鐘

洗板3次,加入ABC工作液,37℃反應30分鐘

洗板5次,加入TMB顯色液,37℃反應

加入TMB終止液

10分鐘之內酶標儀測OD

計算標本待測因子含量


試劑盒參數

【檢測范圍】300pg/ml-4.7pg/ml

【靈敏度】最小可測人IL-61pg/ml.

【特異性】系統和其它因子無交叉反應。

【批間差】≤12%.

【批內差】≤8%.

【回收率】70-110%.

【保存】-20℃ [短期內(如兩周)可4℃]
【用途】用于體外定量分析液體標本(通用型)。

【規格】96T.

【生產日期】見酶標板鋁箔袋封口鋼印。

【有效期】12個月(-20℃.

【參考文獻】

1 .Seigel, L.J.et al.(1984) Science 223:175.

2. Minami, Y.et al.(1993) Annu. Rev. Immunol. 11:245.

3. Sugamura, K.et al.(1995) Advances in Immunol. 59:225.

4Grabstein, K.H.et al.(1994) Science 264:965.

5. Giri, J.G. et al.(1994) EMBO 13:2822.

6. Noguchi, M. et al.(1993) Science 262:1877.

7. Kondo, M.,et al.(1993) Science 262:1874.




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